VEGF ELISA試劑盒
日本IBL*，貨號：27171
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前言說明
血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種同型二聚體蛋白，zui初人們是從富含正常牛垂體濾泡星形蛋白細(xì)胞的基質(zhì)中分離純化得到，由各種血管組織分泌。后來人們發(fā)現(xiàn)VEGF與一種血管通透因子（VPF）相同， VPF是之前在富含腫瘤細(xì)胞系的基質(zhì)中鑒別得到的，腫瘤細(xì)胞可以提高毛細(xì)血管的通透性。據(jù)報道，VEGF的活性包括促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長，促進(jìn)血管的生成和提高毛細(xì)血管的通透性。VEGF是一種分子量為38.2kDa的同型二聚體，它由兩條含165個氨基酸的多肽鏈組成。多數(shù)人腫瘤細(xì)胞都會分泌VEGF，包括：人肺腺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、纖維肉瘤、HL60早幼粒細(xì)胞性白血病、GS-9L神經(jīng)膠質(zhì)瘤和U937淋巴瘤細(xì)胞。一些正常的組織也會分泌VEGF，如：活化的巨噬細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、肝細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞、支氣管及脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞，腎小球內(nèi)臟上皮及其系膜細(xì)胞。IBL公司的人VEGF ELISA試劑盒可用于人EDTA血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的定量檢測。
實驗原理
此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒，使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑，zui終溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中VEGF的量成正比。
測定范圍
15.63～1000pg/ml （*次溫育：37℃下溫育60min）
7.81～500pg/ml （*次溫育：4℃下溫育過夜）
預(yù)期用途
此試劑盒可用于人EDTA血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液上清EGF的體外定量檢測。此試劑可識別天然的和重組的VEGF。利用夾心法的酶聯(lián)免疫吸附實驗，采用用了高特異性的多克隆抗體和單克隆抗體。
試劑盒成分
1） 包被板：微孔中包被了抗人VEGF-1（16F1）的鼠IgG單克隆抗體，96孔。
2） 濃縮型酶標(biāo)抗體：HRP標(biāo)記的抗人VEGF-1兔IgG Fab片段，30倍濃縮，0.4ml
3） 標(biāo)準(zhǔn)品：內(nèi)含重組的人VEGF 165，0.5ml×2
4） EIA緩沖液：1%的BSA，含0.05%的吐溫的PBS，30ml
5） 酶標(biāo)抗體稀釋液：內(nèi)含的1%BSA、0.05%吐溫20的PBS，12ml
6） 顯色劑：TMB底物液，15ml
7） 終止液：1N的H2SO4，12ml
8） 濃縮洗滌液：內(nèi)含0.05%吐溫的磷酸緩沖液（40倍濃縮），50ml。
實驗所需器材但試劑盒不提供
l 酶標(biāo)儀（450nm）
l 帶刻度的量筒與燒杯
l 孵箱（37℃±1℃）
l 吸水紙
l 冰箱（4℃）
l 試管
l 微量移液器和取樣吸頭
l 去離子水
l 坐標(biāo)紙（log/log）
l 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的試管
l 洗滌瓶
試劑準(zhǔn)備
1. 洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi)，并于2周內(nèi)使用
2. 標(biāo)記抗體的制備：用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋30倍，即得。
例：如果只測一條板，8孔，則需要標(biāo)記抗體800ul（30ul的標(biāo)記抗體+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔加100ul）
此步驟在實驗前完成
剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶內(nèi)，保存在4℃
3. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：吸取0.5ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶內(nèi)，充分混勻，得到2000pg/ml的人VEGF標(biāo)準(zhǔn)品
4. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備8個試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管 1000pg/ml
2號管 500pg/ml
3號管 250pg/ml
4號管 125pg/ml
5號管 62.5pg/ml
6號管 31.25pg/ml
7號管 15.63pg/ml
8號管 0pg/ml（試驗樣品空白）
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續(xù)稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品范圍為1000~15.63pg/ml
5. 樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有估計，我們建議，先用幾個不同稀釋比例的樣品進(jìn)行檢測，來確定樣品的*稀釋比例
實驗步驟
使用前，所有樣品應(yīng)平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質(zhì)量無變化，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測同時進(jìn)行
| 試劑 | 檢測樣品 | 標(biāo)準(zhǔn)品 | 檢測樣品對照孔 | 試劑對照孔 |
| 檢測樣品100ul | 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1-7管）100ul | EIA緩沖液（第8管） 100ul | EIA緩沖液100ul |
| 蓋板，37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜 |
| 洗板7次 |
| 酶標(biāo)抗體 | 100ul | 100ul | 100ul | - |
| 蓋板，4℃下溫育30min |
| 洗板9次 |
| 顯色劑 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 室溫避光溫育30min |
| 終止液 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 加終止液后30min內(nèi)450nm處讀取OD值 |
1） 確定好空白對照孔，并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
2） 確定好樣品對照孔，檢測樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的微孔中。
3） 蓋板，37℃下溫育60min或4℃下溫育一夜
4） 用洗滌瓶洗板，在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒，棄取洗滌液。重復(fù)7次，zui后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機(jī)洗板時，用洗板機(jī)洗四次后，在用洗滌瓶洗3次。
5） 每孔加100ul酶標(biāo)抗體，除試劑空白對照孔外
6） 蓋板，4℃下溫育30min
7） 按照步驟4）洗板9次
8） 將所需量的顯色劑加入到試管中，然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。為了避免污染，請勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。
9） 室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍(lán)色
10）在每孔加100ul終止液，此時溶液顏色會變成黃色。
11） 擦去微孔板底部的污點(diǎn)或水滴，終止液加入后30min內(nèi)，在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)
特別注意
1. 試驗樣品采集后應(yīng)立即檢測，凍存的樣品避免反復(fù)凍融，檢測前應(yīng)先將其*溶解混勻
2. 試驗樣品用EIA緩沖液稀釋
3. 試驗樣品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)做雙份檢測
4. 試驗樣品應(yīng)在中性PH范圍，有機(jī)溶劑的污染可能會影響檢測
5. 只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，否則會導(dǎo)致試驗失敗
6. 吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭
7. TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬
8. 加入終止液后30min內(nèi)必須酶標(biāo)儀讀數(shù)
9. 肝素血漿樣品的檢測值低于EDTA血漿樣品
結(jié)果計算
繪制曲線前，所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)減去試驗樣品空白值，包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知的樣品。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度在對數(shù)-對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
附：采用全自動酶標(biāo)儀檢測，只需檢測前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù)，如坐標(biāo)參數(shù)（線性，半對數(shù)）和計算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程），即可直接得到結(jié)果
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。
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